康迈迪森研发团队与加州大学旧金山分校Brian Shoichet课题组的一项新冠病毒研究最新成果日前被Protein Science杂志接受发表。该研究题为”Large library docking for novel SARS-CoV-2 main protease non-covalent and covalent inhibitors“，探索新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶(MPro)的新型抑制剂。
该研究围绕MPro的结构特性，对一个包含12亿分子的非共价先导化合物库和一个包含650万亲电化合物的共价库进行了分子对接，从中确定了29种非共价抑制剂和11种共价抑制剂，共涵盖了37个骨架系列。通过对多个系列进行优化，研究团队获得了低微摩尔抑制剂，并通过进一步的晶体学研究确认了对接预测的化合物结合模式。
这项研究在新冠病毒MPro的新型抑制剂开发方面取得了初步进展，为未来的优化工作提供了可能的模板。研究再一次表明了基于结构的虚拟筛选在新颖活性化合物发现中的有效性，同时也揭示了当前方法在应对复杂靶标时的局限性，为虚拟筛选技术的改进提供了方向。未来，康迈迪森将积极参与小分子虚拟筛选技术相关领域的研究，希望通过持续努力和探索，推动复杂靶点体系的创新小分子开发。
文章主要内容如下：
非共价化合物的筛选
研究基于不同的MPro晶体结构进行了两轮非共价化合物的筛选。
在第一轮筛选中，对接化合物库包含了3.35亿个主要来自ZINC15的lead-like子集的中性分子。对接结果依据配体与Gly143, His163, 或 Glu166形成氢键的能力，以及与Met49和Asp187形成非极性相互作用进行了过滤。在最后挑选的220个分子中，其中194个被Enamine成功合成，12个分子IC50值 < 300μM，命中率为6%。研究人员选择了四个苗头化合物作为基于结构优化的起点，通过类似物搜索及分子对接的方式对其进行优化，鉴定出了两个高活性的抑制剂。通过晶体学研究，研究团队确认了三种优化后的非共价抑制剂与MPro的结合模式。为了发现更多结构新颖的非共价抑制剂，研究人员基于另一个MPro晶体结构进行了第二轮筛选。该结构的结合口袋与第一轮筛选基于的结构有较明显的差异。该轮筛选对接了8.62亿个来自Enamine REAL数据库的中性化合物，并剔除了与1716种SARS-CoV-2 MPro抑制剂的相似性大于0.35的分子，在对优选的9500个化合物进行人工评价后，146个分子被Enamine合成，其中17个化合物对MPro的IC50值 < 200 μM。通过非共价虚拟筛选，研究人员共发现了10类不同的化合物骨架，IC50值均低于150 μM。这些骨架都是全新的MPro抑制剂开发的起始点
共价化合物的筛选
该研究还针对MPro的Cys145残基进行了共价化合物筛选（康迈团队主要参与的部分）。
研究人员首先通过过滤ZINC15/ZINC20数据库的14亿种分子建立了一个包含650万分子的共价化合物库，过滤流程保留了包含三种具备Cys反应活性的共价弹头的化合物，其中包括360万个腈基，150万个醛基，和140万个α-酮酰胺化合物。对接后经过相互作用过滤及结构多样性过滤后选取了35种醛，41种腈，和21种α-酮酰胺进行合成与测试，共发现11种IC50 < 150 μM的活性化合物，命中率15%。
研究人员针对其中一种醛类化合物进行了优化，发现了多种活性更好的类似物，其中最好的共价抑制剂7021是一种可逆共价抑制剂，IC50为1 μM。进一步开展的晶体学研究揭示了五种共价活性化合物与MPro的复合物结构。这些化合物的结构与对接预测高度一致，每个抑制剂中的吡啶氮与Gly143形成氢键，硫醛酮加成物与酶的氧阴离子孔中Cys145的主链形成氢键。位于远离芳环上的疏水基团与S2/S3口袋中的残基（包括Met49和Phe181）相互作用。
抑制活性检测
研究进一步探索了新发现的几种抑制剂对不同冠状病毒的MPro以及新冠病毒中不同MPro突变株的抑制活性。抑制剂7021对SARS-CoV-1 MPro（IC50为8μΜ）和SARS-CoV-2 MPro（IC50为1μΜ）均有活性，但对MERS MPro的抑制效果较弱（IC50为50μΜ）。针对几种已发现与Paxlovid抗药性相关的突变株，几种新发现的化合物的抑制活性受到不同程度的影响。
总的来说，与Paxlovid的活性成分奈玛特韦相比，新抑制剂的较小尺寸似乎使它们对这些现有药物诱导的突变更具抗性，推测比奈玛特韦更小且更紧密围绕催化中心的分子可能比现有较大的Mpro抑制剂对突变更不敏感。
总结
本研究通过基于结构的虚拟筛选识别出了132种新冠病毒MPro抑制剂，覆盖了37个不同的骨架类别。其中，3个骨架对应的15种抑制剂的IC50值小于10 μM，活性最高的是一种可逆醛类共价抑制剂，IC50值为1 μM，这反映了醛类共价抑制剂的快速结合/快速解离的动力学特性。新抑制剂的8种晶体结构与对接预测结果高度一致。同时，这些抑制剂也能以类似的效力抑制其他病毒的MPro酶，并对新冠病毒MPro的耐药突变株有一定的抑制活性。相比于研究团队既往使用类似方法在其他体系如GPCR上进行的大规模虚拟筛选，本研究的命中率明显偏低，命中化合物的活性也相对偏低，原因主要是MPro的结合位点相对平坦以及较多暴露在溶剂中。对于此类靶点，采用基于片段的方法可能会更有优势。尽管如此，本研究通过揭示多种新颖的MPro抑制剂骨架家族及通过实验验证的复合物结合模式为新颖的MPro抑制剂开发提供了很好的出发点。
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